张怡堃主任、解放军总医院、第九医学中心、血液科
摘要： 本文详细探讨了长链非编码 RNA NONMMUT004552.2 在小鼠骨代谢中的作用机制，以及其对卸载诱导骨丢失的影响。通过研究发现，该 lncRNA 通过与 miRNA - 15b - 5p/Syne1 相互作用，在调节成骨细胞功能和骨形成过程中发挥关键作用，为骨质疏松等骨骼疾病的治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。同时，文章还强调了深入研究 lncRNAs 在骨生物学中作用的重要性，以及未来研究方向和面临的挑战。
一、引言骨骼系统作为人体的重要支撑结构，其健康状况直接影响着我们的生活质量。骨质疏松症作为一种常见的骨骼疾病，以骨强度下降、骨折风险增加为主要特征，给患者带来了巨大的身体痛苦和经济负担。据统计，全球约有 2 亿女性患有骨质疏松症，而男性患者也达到了约 1.2 亿。在我国，60 岁以上人群中骨质疏松症的患病率高达 22.6%，其中女性患病率更是高达 28.6%。这些数据表明，骨质疏松症已经成为一个全球性的公共健康问题，迫切需要深入研究其发病机制，寻找有效的治疗方法。
长链非编码 RNAs（lncRNAs）作为一类长度超过 200 个核苷酸的非编码 RNA 分子，近年来在基因表达调控领域备受关注。它们广泛参与了细胞的各种生理和病理过程，包括细胞增殖、分化、凋亡以及疾病的发生发展等。在骨骼生物学领域，越来越多的研究表明 lncRNAs 在骨形成和骨吸收过程中发挥着重要的调控作用。例如，lncRNA H19 通过调节成骨细胞和破骨细胞的功能，影响骨代谢平衡；lncRNA MEG3 可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，增加骨形成。然而，尽管已经取得了一些进展，但 lncRNAs 在骨代谢中的具体作用机制仍有许多未知之处，需要进一步深入研究。
二、研究背景与目的在长期的卧床休息或太空飞行等微重力环境下，人体骨骼会面临卸载诱导的骨丢失问题。这是因为机械负荷的减少会导致骨组织中的成骨细胞活性降低，破骨细胞活性相对增加，从而打破了骨形成和骨吸收之间的平衡，最终引起骨量减少和骨质疏松。在航天领域，宇航员在太空飞行期间，由于微重力环境的影响，骨质流失速度明显加快，每月可达 1% - 2%，这使得他们在返回地球后骨折的风险大大增加。
本研究旨在深入探讨长链非编码 RNA NONMMUT004552.2 在卸载诱导骨丢失过程中的作用及其机制。通过对该 lncRNA 的研究，我们希望能够揭示新的骨代谢调控途径，为骨质疏松症等骨骼疾病的治疗提供新的理论基础和潜在的治疗靶点。
三、研究方法与过程（一）动物模型建立研究人员选用了 6 月龄的雄性 C57BL/6J 小鼠，将其随机分为四组：对照组、HU 组、HU+si - NONMMUT004552.2 组和 HU+si - NC 组，每组 6 只小鼠。采用后肢卸载（HU）模型来模拟微重力环境下的骨丢失情况，具体操作是将小鼠的尾巴用手术胶带固定，使其仅靠前肢支撑体重，后肢处于卸载状态，持续 4 周。在实验前，通过尾静脉注射将靶向 lncRNA NONMMUT004552.2 的 siRNA（si - NONMMUT004552.2）或阴性对照 siRNA（si - NC）封装到骨形成区域，每天注射剂量为 2mg/kg，连续注射 3 天。
（二）细胞培养与处理细胞培养从中国科学院购买小鼠 MC3T3 - E1 成骨细胞，在含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的 α - MEM 培养基中培养，培养条件为 37°C、5% CO₂和 95% 湿度。细胞传代至 8 - 12 代后，用含有 10mM β - 甘油磷酸、100nM 地塞米松和 50μM 抗坏血酸的成骨培养基进行诱导培养。细胞转染设计并合成 lncRNA NONMMUT004552.2 的 siRNA（si - NONMMUT004552.2）和阴性对照 siRNA（si - NC），以及全长 Syne1 基因组 DNA 插入 pcDNA3.1 载体构建的 Syne1 过表达载体（Syne1）。使用 Lipofectamine 3000 将这些试剂转染到 MC3T3 - E1 细胞中，同时设置相应的阴性对照。（三）实验检测技术实时荧光定量 PCR（qRT - PCR）用于检测细胞或组织中基因的表达水平，以 GAPDH 作为内参基因，通过计算 2 - ΔΔCt 来确定相对基因表达量。蛋白质免疫印迹（Western blotting）提取组织或细胞中的蛋白质，通过 SDS - PAGE 凝胶电泳分离，转印到 PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测 Bcl - 2、Bax、cleaved - caspase - 3 和 Syne1 等蛋白的表达水平，β - actin 作为加载对照。细胞凋亡检测采用 Annexin V - FITC/PI 双染法，通过流式细胞术检测细胞凋亡率；同时使用 Hoechst 33258 染色观察细胞核形态变化，以确定细胞凋亡情况。成骨细胞功能检测碱性磷酸酶（ALP）活性测定：收集细胞上清液，使用商业试剂盒测定 ALP 活性，并通过 BCA 蛋白测定试剂盒将其归一化到蛋白含量。ALP 染色：用 4% 多聚甲醛固定细胞，然后用 NBT/BCIP 染色试剂盒对 ALP 进行染色，观察成骨细胞的分化情况。茜素红染色：将细胞培养 21 天后，用 70% 乙醇固定，然后用茜素红 S 染色，观察钙结节形成情况，以评估成骨细胞的矿化能力。通过向染色后的细胞中加入 5% 高氯酸，测量 420nm 处的吸光度来定量钙结节的含量。RNA 荧光原位杂交（RNA - FISH）用于检测 lncRNA NONMMUT004552.2 和 miR - 15b - 5p 在 MC3T3 - E1 细胞中的定位，用 CY3 和 FAM 荧光团分别标记 lncRNA NONMMUT004552.2 和 miR - 15b - 5p，DAPI 染色细胞核，然后在共聚焦显微镜下观察。免疫荧光染色（Cyto - Immunofluorescence）用 4% 多聚甲醛固定 MC3T3 - E1 细胞，0.025% Triton X - 100 通透处理，1% 山羊血清封闭，然后用抗 Syne1 抗体（1:100）在 4°C 过夜孵育，再用 FITC 标记的二抗孵育 1 小时，DAPI 染色细胞核，最后在共聚焦显微镜下观察 Syne1 的表达和定位。双荧光素酶报告基因实验构建含有野生型或突变型 lncRNA NONMMUT004552.2 和 Syne1 3'UTR 的荧光素酶报告基因载体，将其与 miR - 15b - 5p mimic 或 inhibitor 共转染到 MC3T3 - E1 细胞中，通过检测荧光素酶活性来验证 lncRNA NONMMUT004552.2 与 miR - 15b - 5p 以及 miR - 15b - 5p 与 Syne1 之间的相互作用。四、研究结果与分析（一）lncRNA NONMMUT004552.2 对骨形成和成骨细胞活性的影响动物实验结果通过对 HU 小鼠模型的研究发现，与对照组相比，HU 组小鼠远端股骨中 TUNEL + 细胞数量显著增加，表明细胞凋亡增多；Bglap + 成骨细胞数量明显减少，说明成骨细胞活性降低；H&E 分析显示总骨面积减少，骨形成指标矿物沉积率（MAR）也显著降低。而在 HU+si - NONMMUT004552.2 组中，与 HU+si - NC 组相比，TUNEL + 细胞数量减少，Bglap + 成骨细胞数量增加，骨面积和骨形成指标均有所恢复。这表明敲除 lncRNA NONMMUT004552.2 可以减轻后肢卸载导致的骨形成减少和成骨细胞活性降低。细胞实验结果在体外培养的 MC3T3 - E1 成骨细胞中，转染 si - NONMMUT004552.2 后，通过 qRT - PCR 检测发现 lncRNA NONMMUT004552.2 的表达明显降低。CCK - 8 实验结果显示细胞增殖能力显著增强，说明 lncRNA NONMMUT004552.2 对成骨细胞增殖有抑制作用。同时，细胞凋亡检测结果表明，转染 si - NONMMUT004552.2 后凋亡细胞数量减少，凋亡相关蛋白 Bax 和 cleaved - caspase - 3 的表达降低，抗凋亡蛋白 Bcl - 2 的表达增加，进一步证实了 lncRNA NONMMUT004552.2 能够促进成骨细胞凋亡。此外，茜素红染色和 ALP 活性测定结果显示，敲低 lncRNA NONMMUT004552.2 后成骨细胞的矿化能力增强，表明其对成骨细胞矿化有抑制作用。（二）lncRNA NONMMUT004552.2 与 miR - 15b - 5p 的相互作用RNA - FISH 结果RNA - FISH 实验显示 lncRNA NONMMUT004552.2 和 miR - 15b - 5p 在 MC3T3 - E1 成骨细胞的细胞质中存在较高水平的共定位，这提示两者可能在细胞质中发生相互作用。生物信息学分析与双荧光素酶报告基因实验结果生物信息学分析预测 lncRNA NONMMUT004552.2 序列中含有与 miR - 15b - 5p 结合的位点，而双荧光素酶报告基因实验进一步证实了这一预测。将含有野生型 lncRNA NONMMUT004552.2 的报告基因载体与 miR - 15b - 5p mimic 共转染到 MC3T3 - E1 细胞中，发现荧光素酶活性显著降低，而将含有突变型 lncRNA NONMMUT004552.2 的报告基因载体与 miR - 15b - 5p mimic 共转染时，荧光素酶活性未受明显影响。此外，qRT - PCR 结果显示，转染 si - NONMMUT004552.2 后 MC3T3 - E1 细胞中 miR - 15b - 5p 的表达水平明显升高，这进一步证明了 lncRNA NONMMUT004552.2 可以与 miR - 15b - 5p 结合并影响其表达。（三）miR - 15b - 5p 与 Syne1 的靶向关系及对成骨细胞的影响生物信息学预测与双荧光素酶报告基因实验结果生物信息学分析预测 miR - 15b - 5p 的靶基因是 Syne1，双荧光素酶报告基因实验证实了这一靶向关系。将含有野生型 Syne1 3'UTR 的报告基因载体与 miR - 15b - 5p mimic 共转染到 MC3T3 - E1 细胞中，荧光素酶活性显著降低，而将含有突变型 Syne1 3'UTR（miR - 15b - 5p 结合位点突变）的报告基因载体与 miR - 15b - 5p mimic 共转染时，荧光素酶活性未受明显影响。细胞实验结果在 MC3T3 - E1 细胞中，转染 miR - 15b - 5p inhibitor 或过表达 Syne1 后，通过 Western blotting 检测发现 Syne1 的蛋白表达水平升高。同时，在微重力卸载环境下，与 MG+si - NC 组相比，MG+si - NONMMUT004552.2 组细胞的增殖能力增强、凋亡减少，而共转染 miR - 15b - 5p inhibitor 或 Syne1 后，这种促进增殖和抗凋亡的作用被部分逆转。此外，在成骨分化方面，MG+si - NONMMUT004552.2 组细胞中 Runx2、Col1a1、Bglap 和 ALP 等成骨基因的表达升高，ALP 活性和染色以及基质矿化水平也增加，而共转染 miR - 15b - 5p inhibitor 或 Syne1 后，这些成骨指标的升高被部分抑制。这表明 miR - 15b - 5p 通过靶向 Syne1 参与了 lncRNA NONMMUT004552.2 对成骨细胞功能的调控。（四）lncRNA NONMMUT004552.2/miR - 15b - 5p/Syne1 轴在卸载诱导骨丢失中的作用机制综合以上结果，我们可以得出以下结论：在微重力卸载环境下，lncRNA NONMMUT004552.2 的表达升高，它通过与 miR - 15b - 5p 结合，降低了 miR - 15b - 5p 对其靶基因 Syne1 的抑制作用，从而导致 Syne1 表达增加。Syne1 的高表达进而抑制了成骨细胞的增殖、分化和矿化，促进了成骨细胞的凋亡，最终导致骨形成减少，骨丢失增加。这一机制的揭示为我们理解卸载诱导骨丢失的病理过程提供了新的视角，也为寻找治疗骨质疏松症等骨骼疾病的新靶点提供了理论依据。
五、研究意义与展望（一）对骨骼疾病治疗的潜在价值本研究发现的 lncRNA NONMMUT004552.2/miR - 15b - 5p/Syne1 轴为骨质疏松症的治疗提供了新的潜在靶点。通过干预这一调控轴，有可能开发出新型的治疗药物或治疗策略，以促进成骨细胞的功能，增加骨形成，从而改善骨质疏松症患者的骨密度和骨质量，降低骨折风险。例如，可以设计针对 lncRNA NONMMUT004552.2 的小分子抑制剂或反义寡核苷酸，来降低其表达水平，进而调节下游的 miR - 15b - 5p 和 Syne1 的表达，达到治疗骨质疏松症的目的。此外，对于其他与骨代谢异常相关的疾病，如骨折愈合延迟、骨关节炎等，这一研究成果也可能具有一定的启示作用，为开发新的治疗方法提供理论基础。
（二）对骨生物学研究的推动作用本研究深入揭示了 lncRNA 在卸载诱导骨丢失过程中的重要作用及其调控机制，进一步丰富了我们对骨生物学中复杂分子调控网络的认识。这将有助于推动骨生物学领域的研究向更加深入和细致的方向发展，激发更多的研究人员关注 lncRNAs 在骨代谢中的作用，从而发现更多与骨骼健康相关的调控分子和信号通路。同时，本研究中所采用的多种实验技术和方法，如动物模型构建、细胞培养与转染、RNA - FISH、双荧光素酶报告基因实验等，也为其他研究人员在骨生物学及相关领域的研究提供了有益的参考和借鉴。
（三）未来研究方向与挑战尽管本研究取得了重要的成果，但仍有许多问题需要进一步探索。例如，lncRNA NONMMUT004552.2 在其他生理和病理条件下的表达和功能如何？它是否还与其他分子或信号通路相互作用，共同调节骨代谢？在体内环境中，如何实现对 lncRNA NONMMUT004552.2/miR - 15b - 5p/Syne1 轴的精准调控，以达到最佳的治疗效果且避免潜在的副作用？此外，开发针对 lncRNAs 的有效治疗药物或技术仍然面临诸多挑战，如药物的特异性、稳定性、递送效率等问题都需要解决。未来的研究需要进一步深入探讨这些问题，以推动这一领域的研究成果向临床应用转化。
六、结论综上所述，本研究首次揭示了长链非编码 RNA NONMMUT004552.2 在小鼠卸载诱导骨丢失过程中的重要作用及其调控机制。通过与 miR - 15b - 5p 和 Syne1 的相互作用，lncRNA NONMMUT004552.2 调节了成骨细胞的功能，影响了骨形成和骨丢失的平衡。这一研究成果为骨质疏松症等骨骼疾病的治疗提供了新的理论依据和潜在靶点，同时也为骨生物学领域的研究提供了新的思路和方向。然而，要将这些研究成果转化为有效的临床治疗方法，还需要克服许多技术和实践上的挑战，需要广大科研人员的共同努力。相信在未来，随着研究的不断深入，我们将能够更好地理解骨骼疾病的发病机制，开发出更加有效的治疗手段，为改善患者的骨骼健康和生活质量做出更大的贡献。
