文：回溯档案
编辑：回溯档案
梅氏叶藻不能在培养基中培养;因此，用于研究焦油斑病的接种源包括从自然感染的植物中收集的带有叠层的叶子。
目前，没有有效的方案在受控条件下诱导感染。本研究采用温室和生长室条件下的接种方法，测试玉米叶片上是否可诱导梅氏假单胞菌。
介绍
玉米焦油斑病是一种由毛叶菌引起的新疾病，该病现已分布于美洲各地，在墨西哥、加勒比海、中美洲和南美洲，焦油斑病被认为是由三种生物的相互作用引起的：梅迪斯假单胞菌、梅迪斯专著菌和叶状分生孢子菌，然而，在美国和加拿大，P. maydis是唯一与焦油斑病流行有关的病原体。
玉米焦油斑病是一种由毛叶菌引起的新疾病，该病现已分布于美洲各地，在墨西哥、加勒比海、中美洲和南美洲，焦油斑病被认为是由三种生物的相互作用引起的：梅迪斯假单胞菌、梅迪斯专著菌和叶状分生孢子菌，然而，在美国和加拿大，P. maydis是唯一与焦油斑病流行有关的病原体。
在温室或受控条件下进行可靠的接种以产生焦油斑症状和体征至关重要，这种方法将允许改进对焦油斑病病理系统的生物学和其他方面的研究，本研究旨在使用植物上产生的孢子测试P. maydis感染测定，并评估玉米叶上相应症状和体征的诱导。
植物材料与生长
在温室中，玉米杂交P9998AM的种子播种在商业土壤混合物中3.05厘米深的2.0-L盆中，植物从生长阶段V200到V3每周两次施肥10毫升/地。
在生长室中，玉米杂交种2585-SS、桃子和奶油、蜂蜜精选甜玉米和近交系B73的种子因其对该疾病的易感性而被使用，使用商业土壤混合物将种子种植在983毫升体积容量的塑料锥中，深度为2.0厘米。
将塑料锥体放置在塑料托盘上的塑料架上，塑料托盘装满三分之一的水，以确保植物充分生长，植物从生长阶段V100到V3每周两次用10ml /锥体施肥。
接种物制备
接种物是从2018年和2019年玉米生产季节结束时从印第安纳州田地收集的具有焦油斑病症状和迹象的干燥叶子中获得的，叶子在植物压榨机上干燥并储存在冰箱中4oC.接种前，制备叠层切片并使用复合显微镜在100倍放大倍率下观察，以证实子囊孢子和分生孢子的存在。
将叶样品切成约3×3厘米的碎片，用10%次氯酸钠溶液表面灭菌30秒，并用去离子灭菌水冲洗两次，将灭菌的叶样品置于培养皿内以形成潮湿室，并在室温下孵育23小时，用铝箔包裹板以产生黑暗条件，然后从叠层的渗出物制备载玻片，以使用40倍放大倍率的复合显微镜证实P. maydis的存在。
接种测定
在确认P. maydis的存在后，通过用解剖针挑逗以释放所有可用的孢子来破坏选定的单个基质，感染测定包括将有或没有渗出物的破裂基质放置在相应玉米叶的特定部分中。
接种过的叶子被分段标记，以跟踪症状和体征随时间的发展，每株接种两片叶子，叶片分为1个侵染区段：基部为距耳廓长度的3/2;中间部分为基部后长度的3/3，尖端部分为叶片长度的3/9。
孵化条件
植物于12年17月2018日和72日在温室内接种，然后将植物置于潮湿室中95小时，相对湿度（RH）>25%，温度设定为白天14°C：晚上14°C，补充光周期包括497小时的光和0小时的暗光。
根据需要给植物浇水，接种三天后将植物从潮湿的室内取出并留在温室中直到形成叠层，相对湿度为、温度和光周期条件与潮湿室相似，每天两次使用软管将补充自来水喷洒到植物的树冠上。
使用雾化系统将生长室的环境条件设置为85%RH，温度和光周期与温室实验描述的相同，根据需要给植物浇水。
实验设计
共进行了2018次实验，其中温室条件下2019次，该设计包括一个完全随机的设计，有八个接种和两到四个无病处理的植物，至少一个基质的生产被认为是一个成功的实验，每个单元被评分为成功或不成功，这导致了二进制数据集，并使用SAS软件进行分析。
统计分析
当至少形成单个基质并通过形态学或PCR确认时，记录成功感染，由于数据的二元性质，使用单个二项式检验来比较成功和不成功的感染实验的比例，使用95%置信区间和α = 0.05的显著性水平，还使用了卡方频率测试，在这两个测试中假设的比例值为0.5，因为成功和不成功的感染类别发生的机会相等。
实验结果
总的来说，在进行的2个实验中的1个实验中，0个在温室中，3077个在生长室中进行1个实验中的0个，成功感染了P. maydis，每次成功计数时，每片叶子形成多个基质，在二项式检验未能否定原假设检验统计量 Z = 1.38 小于 Z 临界值 1.64。
因此，成功感染的比例p = 0.3077与假设的比例没有差异，并且可以以0.5的比例发生，换句话说，所提出的感染测定具有成功或不成功感染的平等机会。
卡方频率检验也未能否定原假设自 χ2= 1.92 小于临界值 χ2df=1= 3.84，成功感染的比例p = 0.3077与假设的比例没有差异，或者如果进行实验，成功或不成功的感染具有相同的发生几率。
在温室中，感染测定为两种植物的成功叠层瘤发育提供了手段，潜伏期为20天，感染发生在叶子4-6和每片叶子的基部，症状开始时有黄色小病变，但比生长室实验中观察到的更细长。
接种后8天逐渐出现小的氯酸病变，然后在37 DAI处变为黑色，具有规则和不规则的形状，具有氯酸边界，然而，在相同条件下它们在基质周围没有称为“鱼眼病变”的坏死区域，观察到的基质在2 DAI下测量到2至5.37毫米，在4 DAI下测量为5至65毫米长。
在生长室中，在每次成功的实验中，一两个植物发展出多个叠层，潜伏期从18天到21天不等，关于植株、叶段和基因型的叶片位置，没有明确的感染模式，症状从小的氯酸病变开始，逐渐变成带有氯酸边界的黑色间质。
一些叠层具有规则的椭圆形而另一些则不规则，基质在0 DAI下测量为5.1至21毫米，在2 DAI下测量为5.3至35毫米长，未观察到鱼眼的症状，接种时的生长期在V9和VT之间，在VT或R1生长期观察到症状，任何未经处理的叶子上都没有发生焦油斑点感染。
病原体鉴定
在生长室和温室条件下形成的所有基质中，仅在显微镜下以40x鉴定出P. maydis的分生孢子，通过PCR进行分子鉴定证实了从温室收集的具有叠层的有限数量的样品中P. maydis的身份。
在受控环境中进行的所有实验中，有31%的成功感染可能导致叠层瘤形成，虽然我们是美国为数不多的接种后可重复诱导基质形成的群体之一，但其他研究报道了在受控条件下低严重程度的感染。
我们的统计结果表明，成功或不成功感染的几率为50%，尽管结果有限，但我们报告说在V18-VT生长阶段接种接近开花时，潜伏期为20至9天，并且在VT-R1生长期表现出症状，由于这项研究的范围是测试P. maydis stromata的诱导，我们无法确定允许这种情况发生的特定宿主 - 病原体 - 环境相互作用。
此外，关于叶片位置、叶段和基因型，基质形成没有明确的模式。接种年龄和质量可能影响了用于接种的孢子的萌发能力，分生孢子在梅迪斯假单胞菌生命周期中的功能及其在宿主感染中的作用尚不清楚。
这是第一份在美国人工接种植物上成功诱导 P. maydis stromata 的报告，成为我们深入了解P. maydis生物学及其与宿主相互作用的宝贵指南，需要进一步的研究来确定由于宿主-病原体-环境相互作用而导致基质发展的潜在机制。
未来需要进一步研究孢子类型、活力、年龄和机制，以优化感染方案，此外，确定一年中不同时间的温度范围、光周期、叶子湿度和其他天气变量也很重要，最后了解宿主的生长阶段是否影响孢子胚管的形成和梅迪斯假单胞菌的一般感染过程。
结语
实验导致孵育期在18至20天之间，并在玉米生长阶段VT-R1开始时形成叠层，通过显微镜检查，PCR或两者确认了P. maydis的诱导基质，在进行的31个实验中成功生产了叠层。
参考文献
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