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软材料生物电子学可实现从单细胞到器官级的生物功能检测。在动态变化的体内环境中，软性生物界面可以适应活体组织的持续机械变形，从而为生物系统提供可靠的通道。对于复杂而精细的神经系统界面，弹性聚合物材料，包括聚二甲基硅氧烷（PDMS）、环烯烃共聚弹性体（COCE）、聚氨酯（PU）和水凝胶已被用作多功能设备的适当弹性基底，这些设备可实现神经光遗传学刺激、电生理记录、药物输注和神经递质检测。然而，在软弹性器件中制造专用微结构仅限于二维（2D）结构，而且严重依赖于光刻和微打印等复杂的制造方法。

来自美国纽约州立大学宾汉姆顿分校的Qianbin Wang和Siyuan Rao团队开发了一种通过控制变质聚合物的非晶-晶体转变来实现微型化并将多个组件集成到水凝胶生物电子器件中的制造方法。本研究实现了化学交联聚乙烯醇水凝胶纤维在完全水合状态下直径缩小约 80%。这种策略可以调节水凝胶的特性，包括折射率（1.37-1.40，480 纳米）、透光率（>96%）、拉伸性（139-169%）、弯曲刚度（4.6 ± 1.4 N/）和弹性模量（2.8-9.3 MPa）。为了扩展其应用，在小鼠腹侧被盖区应用了阶跃指数水凝胶光学探针，并结合了纤维光度记录和社会行为测定。此外，还在水凝胶中加入导电纳米材料，制作了碳纳米管-PVA 水凝胶微电极，用于记录自发神经活动。本研究实现了同时对通道色素-2 转基因小鼠进行光遗传刺激和光触发神经活动的电生理记录。相关工作以题为“Control of polymers’ amorphous-crystalline transition enables miniaturization and multifunctional integration for hydrogel bioelectronics”的文章发表在2024年04月25日的国际顶级期刊《Nature Communications》。

1. 创新型研究内容

本研究开发了一套交联化学和微制造工艺，用于控制交联 PVA 水凝胶的聚合物结晶域生长。在生理条件下（pH 值 6-8，37℃），水凝胶在水合状态下可持续实现稳定且可调的体积减小。通过影响聚合物链相互作用的酸化处理，同时引入无机粘合剂正硅酸四乙酯（TEOS）和普通戊二醛（GA）的双重交联剂，最大限度地减少了多晶体散射（晶体大小约为 3.5 nm），并提高了水凝胶的折射率（RI）。单轴变形引起的进一步纳米晶体取向促进了纳米级各向异性结构的产生。这种控制变质聚合物无定形-晶体转变（COMPACT）的策略使水合状态下的水凝胶纤维直径减少了 79.7%，同时保持了高拉伸性（139.3-169.2%）、相对较低的弹性模量（2.8-9.3 MPa）和较低的弯曲刚度（4.6 ± 1.4 牛/米）。利用一系列选项控制 COMPACT 水凝胶 RI 的能力，本研究开发了具有明显 RI 对比度（ncore = 1.40，ncladding = 1.34）的芯包层水凝胶纤维。这些包芯结构的水凝胶纤维被应用于小鼠大脑腹侧被盖区（VTA）在社会交往背景下的同步光度记录。利用这些可调水凝胶基质支架的优势，在 COMPACT 水凝胶中加入了导电纳米材料--碳纳米管（CNTs），以制造软微电极，并测试了其对小鼠大脑自发神经活动进行电生理记录的功能。通过整合水凝胶光学核心和 CNTs-PVA 微电极，我们开发出了多功能水凝胶光电器件，并在转基因 Thy1:: ChR2-EYFP 小鼠体内演示了同时光遗传刺激和光触发神经活动的电生理记录。

【水凝胶可控收缩的 COMPACT策略】

化学交联 PVA 水凝胶具有优异的光学特性 、抗疲劳性和生物相容性，已被广泛应用于生物电子学领域。为进一步探索 PVA 水凝胶的可控微型化特性，同时保留这些优势特性，本研究设计了通过控制变质聚合物的非晶-结晶转变的制造方法，包括以下几个方面：（1）聚合物链折叠并用多种交联剂固定；（2）干预水凝胶基质中分子链间的相互作用；（3）诱导纳米结晶畴的定向生长。本研究按照三个主要步骤实施了 COMPACT 战略，以控制单个聚合物链折叠、聚合物链网络相互作用和纳米晶体生长。首先通过均质化引入 TEOS 在 PVA 溶液中的水解（图 1a），然后加入通用交联剂 (GA)。本研究选择了两种交联剂的组合，以便通过共价键控制聚合物链的流动性，并平行调节水凝胶的折射率。然后，对交联水凝胶进行酸化，以促进分子链间的相互作用。通过成型和挤压方法制备了纤维状水凝胶。对完全酸化的水凝胶施加外部机械拉伸，并在干燥过程中保持这种拉伸。去除水凝胶中的水分子后，采用高温（100℃）退火进一步促进纳米晶域的生长和取向。

为检验 COMPACT 策略是否能保持水凝胶在水合状态下的体积收缩，本研究还检测了交联水凝胶在原始、干燥和再水合状态下的尺寸和水分含量（图 1b-e）。在原始状态（图 1b）和干燥状态（图 1c）下，TEOS-GA 交联（COMPACT+）和 GA 交联（COMPACT-）的两种水凝胶纤维显示出相似的几何形状和水分含量（图 1e）；然而，只有 TEOS-GA 交联的 PVA 水凝胶纤维在酸化和机械拉伸后能保持再水化状态下的较小直径（图 1d、e）。

在确认水凝胶经 COMPACT 处理后在再水化状态下仍具有收缩特性后，测试了尺寸缩小是否取决于材料的几何形状和外部限制。本研究制备了薄膜、纤维和块状水凝胶，并检测了 COMPACT 水凝胶薄膜厚度（T，图 1f）、纤维直径（D，图 1g）和体积（V，图 1h）的变化。经酸化处理的 TEOS-GA 交联 PVA 水凝胶薄膜的厚度减少率为 93.4 ± 3.6%（原始厚度：501 ± 134 µm；再水化厚度：33 ± 18 µm，图 1f）。经过酸化和机械应变（200%）处理的 TEOS-GA 交联 PVA 水凝胶纤维的最大直径收缩率为 79.7 ± 2.3%（图 1g）。在三维（3D）自由收缩结构中，观察到酸化 TEOS-GA 交联圆柱体的体积收缩率为 80.9 ± 0.7%（图 1h）。

图1 水凝胶微型化的 COMPACT 战略

【COMPACT 水凝胶纤维的可调特性】

通过 COMPACT 实现的水合水凝胶尺寸缩减，本研究开发出一系列直径可控、光学和机械性能可调的水凝胶纤维，用于生物医学领域。本研究通过改变无机交联剂（TEOS）的含量、酸化和外部机械拉伸，绘制了一张合理而全面的收缩图（图 2a）。一般来说，交联密度越大，交联剂越多，聚合物链的延展性就越差，水化后的尺寸就越小。酸化处理显著提高了不同交联密度的收缩率，而机械静态拉伸则进一步减小了水凝胶纤维的直径（79.7 ± 2.3%）。为了让 COMPACT 适应实用的模塑-挤压制造工艺，研究了一系列使用不同尺寸硅胶模具制造的水凝胶纤维（图 2b）。与模具尺寸无关，所有 COMPACT 水凝胶纤维的直径都缩小了 79% 以上，这与收缩图（图 2a）一致。例如，使用 300 μm（内径）硅胶模具制造出的水凝胶纤维直径为 80 ± 4 μm。

考虑到光纤在体内的应用，本研究探究了 COMPACT 水凝胶纤维的光学、机械和细胞毒性特性。为确保光刺激和记录的高效光传输，考虑了水凝胶纤维芯的两个重要参数：折射率（RI）和透光率。发现水凝胶的折射率可通过 TEOS 含量进行调节。TEOS 含量为 0 wt. % 至 4 wt. % 的 COMPACT 水凝胶在干燥状态下的折射率为 1.48 至 1.60（图 2c），在水合状态下的折射率为 1.37 至 1.40，与其他传统聚合物的折射率相当。虽然透射率都保持在 96% 以上，但 TEOS 含量的增加也会导致透射率下降（图 2c）和自发荧光增加。最佳 TEOS 含量选为 3 wt.%，水凝胶的折射率为 1.54 ± 0.01（图 2c），透射率大于 96%（图 2c，膜厚 0.15 ± 0.02 mm），自发荧光相对荧光单位 (RFU) 为 6.13 ± 0.16。

为模拟体内工作状态，本研究检测了 COMPACT 水凝胶在水合状态下的机械性能。COMPACT 水凝胶纤维表现出相对较低的弹性模量，同时保持较高的伸展性（图 2d）。优化的 COMPACT 水凝胶纤维（3 wt. % TEOS、12 mM HCl 酸化处理和 200% 拉伸，直径：227 ± 18 μm）的弹性模量为 4.8 ± 1.7 MPa，拉伸性为 139.4 ± 26.0%。当纤维状神经探针插入脑组织时，其轴向弯曲刚度是脑微动下的一个重要机械参数。与二氧化硅纤维（弹性模量约为 20 GPa）和聚合物纤维（弹性模量约为 1 GPa）相比，COMPACT 水凝胶纤维与神经组织的机械匹配性更好（1-4 kPa），轴向弯曲刚度更低（图 2e），从而减少了体内研究中微动对神经组织的损伤。本研究的初步评估侧重于植入后 14 天脑组织的免疫反应。与较硬的二氧化硅纤维相比，观察到水凝胶纤维植入部位周围的星形胶质细胞、小胶质细胞积聚、活化的巨噬细胞和免疫球蛋白 G 减少了。随后，评估了 30 天后的慢性免疫反应，发现水凝胶纤维植入部位周围的星形胶质细胞和小胶质细胞形成率低于硅胶纤维植入部位。

图2 可控水凝胶纤维的制造及其特性

【阶跃指数水凝胶光纤】

COMPACT 水凝胶首先被制成阶梯指数光纤。光芯层和包层之间的 RI 对比度增加可确保光的传输，从而提高光检测灵敏度（图 3a）。根据 COMPACT 水凝胶的可调折射率（图 2c），设计了具有高 RI 内芯（ncore = 1.40）和低 RI 包层（ncladding = 1.34）的阶梯指数水凝胶光纤。水凝胶纤维与嵌入光学套圈的二氧化硅段相连，这样既能提供牢固的连接，又能防止直接暴露在组织外的水凝胶脱水和光损失。通过比较裸芯光纤、带有普通包层的阶跃指数光纤和带有光保护包层的光纤之间的透光率，验证了 RI 对比纤芯-包层结构的功能（图 3b、c）。裸芯光纤（直径为 329 ± 17 μm）的衰减相对较高（1.87 ± 0.53 dB/cm），而在 372 ± 10 μm 芯表面引入薄薄的低 RI 包层（厚度为 84 ± 4 μm，ncladding = 1.34）后，光传输衰减降至 1.75 ± 0.08 dB/cm（图 3d）。一种具有代表性的光吸收纳米材料，还原氧化石墨烯（rGO）被添加到低 RI 包层中，以进一步保护光纤侧表面的光泄漏，并因此将光衰减降至 0.94 ± 0.25 dB/cm（纤芯 339 ± 35 μm，包层：36 ± 11 μm 的 5 重量百分比 PVA 与 0.21 重量百分比 rGO）（图 3d）。

为验证其在体内光学检测方面的功能，本研究在小鼠社会行为的背景下对 COMPACT 水凝胶纤维进行了光度记录测试。已利用多种技术研究了与小鼠社交行为相关的 VTA 区域及其相关回路的激活。作为概念验证应用，本研究验证了 COMPACT 水凝胶纤维可对小鼠大脑深层结构 VTA 进行光度记录，并同时观察小鼠的社交行为。在注射含有基因编码钙指示剂（hSyn::GCaMP6s）的腺相关病毒（AAV）后，本研究将 COMPACT 光导纤维（580 ± 35 µm）单侧植入 VTA（图 3e）。水凝胶纤维从干燥状态（硬）到水合状态（软）的硬度变化有助于植入标定的小鼠大脑坐标。使用纤维光度测量系统（波长：λ异相点 = 405 nm，λ激发 = 470 nm，λ发射 = 510 nm）收集 GCaMP 荧光变化，作为反映神经活动的代用指标（图 3f、g）。AAV 表达培养 4 周后，对小鼠进行了社交行为测试，并同时进行了光度记录。使用 DeepLabCut(DLC)无标记姿势估计和定制开发的 MATLAB 算法分析了小鼠的社交互动（图 3f）。观察到 GCaMP 荧光强度的增加与小鼠社交互动时间相关（图 3h）。本研究将细胞水平的神经活动与系统神经科学行为评估联系起来，为神经科学研究提供了发现神经回路与行为因果关系的重要工具。

图3 用于光度记录和行为评估的水凝胶光学神经探针

【多功能水凝胶神经探针】

水凝胶基质可以加入各种纳米级材料，在保持伸展性的同时扩展其功能。为丰富水凝胶神经探针的电记录模式，在水凝胶交联过程中将导电 CNT（长径比为 2000-10000:1）引入 PVA 水凝胶中（图 4a、b）。通过酸化促进聚合物链相互作用和机械拉伸，CNTs 可编织成辫子状进入聚合物基质，并确保与 PVA 链缠结，从而增强了作为渗流网络的导电性。引入 CNT（0.08-0.24 wt.%）后，观察到纳米结晶度变化不大，但纳米结晶尺寸有所减小。这些结果可解释为纳米材料与聚合物链之间的额外相互作用限制了聚合物链的折叠。当 CNTs-PVA 水凝胶纤维经历机械拉伸时，它们保持了各向异性的结构和相似的尺寸。在水凝胶基质中加入刚性碳材料后，CNTs-PVA 复合材料的弹性模量增加（0.16 wt. % CNTs-PVA 水凝胶，39.4 ± 13.7 MPa），拉伸性降低（47.9 ± 12.2%）。为了在用作体内电极，本研究优化了 CNT 的浓度，以平衡导电性和机械性能。用苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯（SEBS）粘弹性涂层绝缘的 CNTs-PVA 水凝胶电极（直径为 86 ± 5 μm，图 4c）在 1 kHz 时的阻抗为 658 ± 277 kΩ，阻抗可通过设计的模具尺寸进行调节，以控制电极直径和 CNTs 的负载量（图 4d、e）。通过在 PBS（37℃，图 4f）中培养 6 周以上、在人工脑脊液（aCSF）中培养 2 周以上以及植入小鼠脑组织，对 CNTs-PVA 电极的稳定性进行了评估。在所有这些条件下，都观察到了稳定的阻抗性能。

图4 集成多功能水凝胶神经探针

2. 总结与展望

通过控制半结晶聚合物的非晶-结晶转变，可直接制造弹性软材料。COMPACT 战略将其扩展到精密光电设备的制造，为水凝胶生物电子学的微型化和集成化提供了一个通用的模块化平台，从而实现了对复杂生物系统的多模式检测。

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