论文荐读

Expi293F表达重组鲎 C 因子用于荧光法内毒素检测

作者：

柯文锋1,2,3 李诗洁1,2,3 郑梦林1,2,3 白仲虎1,2,3 杨艳坤1,2,3∗

单位：

1．江南大学 工业生物技术教育部重点实验室

2．江南大学,粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心

3．江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心

基金项目：

国家重点研发计划(2018YFA0900804) ;国家轻工技术与工程一流学科自主课题( LITE2018-24)

摘要&关键词

摘要：鲎C因子是一种对痕量内毒素高度敏感的丝氨酸蛋白酶原，在医药行业可替代鲎试剂用于内毒素检测。然而其重组表达困难，且对于环境中内毒素的控制要求极高。该文首先克隆了来源于东方鲎的全长C因子，并在N末端和C末端分别添加了Flag标签和6×His标签，同时用哺乳细胞表达载体中的分泌信号肽替换掉了原始C因子信号肽。构建好的重组质粒转染至人胚胎肾脏细胞Expi293F悬浮培养7 d后收获上清液，Western Blot检测蛋白与预测大小128 kDa一致，具有与内毒素结合以及结合后切割荧光底物的能力。该研究首次在人胚胎肾脏细胞 Expi293F 中成功表达出具有生物学活性的全长C因子，表达量达到19.18 mg/L，比DING在昆虫细胞SF9中的表达量提高了113%。该方法对于后续开发低成本内毒素检测试剂盒具有指导意义。

关键词：内毒素检测；鲎C因子；Expi293F；重组表达；脂质体转染

主要结论

为构建有效的重组C因子( recombinant factor C,rfc) 表达体系，本研究克隆了来源于东方鲎（Tachypleus tridentatus）中C因子的全基因序列，首次在人胚胎肾脏细胞Expi293F中进行了重组表达。经检测，rfc在胞外可溶分泌表达，大小与预测一致，初始纯度为48%，经镍柱纯化后的rfc纯度达到98%，得率为56%，相比于SF9细胞，蛋白表达量（19.81 mg/L）提高了113%，大大降低了表达成本。具有与内毒素结合并切割荧光底物的生物学活性。这一表达体系将为重组法试剂盒的开发提供一条崭新的途径，为内毒素检测做出贡献。

a-pcDNA3.4-rfc质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳分析；b-pcDNA3.4-rfc载体图谱

图1 rfc基因的克隆与载体的构建

Fig.1 Cloning and vector construction of rfc

a-细胞培养上清的Western Blot检测（Flag标签）；b-细胞培养上清的Western Blot检测（His标签）

图2 Expi293F细胞中rfc的Western Blot检测

Fig.2 Western Blot detection of rfc expression in Expi293F cells

注：M：蛋白标准分子质量marker；1：非还原性loading buffer处理的细胞培养上清；2：还原性loading buffer处理的细胞培养上清；3：非还原性loading buffer处理的细胞培养上清；4：还原性loading buffer处理的细胞培养上清

a-细胞培养上清的SDS-PAGE检测；b-纯化后的SDS-PAGE检测

图3 rfc的表达与纯化

Fig.3 Expression and purification of rfc

注：M：蛋白标准分子质量marker；1：非还原性loading buffer处理的细胞培养上清；2：非还原性loading buffer处理纯化后的rfc

图4 rfc结合内毒素切割荧光底物

Fig.4 rfc combined with endotoxin to cut fluorescent substrate

注：*代表差异显著（P<0.05）。

在此之前本团队也曾在大肠杆菌BL21（DE3）、毕赤酵母GS115、谷氨酸棒杆菌BZH001中重组表达东方鲎来源的C因子，但遗憾的是，鲎C因子未在大肠杆菌、毕赤酵母、谷氨酸棒杆菌中进行表达，猜测是由于鲎C因子是具有双链结构、多个糖基化位点的大分子蛋白，所以在原核生物以及低等真核生物中无法表达。本研究首次在人胚胎肾脏细胞Expi293F中成功重组表达rfc，结构与蛋白结构模型一致，具有与内毒素结合并切割荧光底物的生物学活性，比Lonza试剂盒中的rfc具有更高的切割荧光底物的能力。且相比于DING在昆虫细胞SF9中的表达量（9 mg/L），此表达体系的蛋白表达量（19.81 mg/L）提高了113%。此方法对于后续开发低成本rfc重组表达体系以及内毒素检测试剂盒具有重要指导意义。

团队介绍

江南大学白仲虎教授团队近年来专注于合成生物学、生物医药和生物反应器领域的研究并取得丰硕成果，相关研究成果已发表在Nature Catalysis(2023)、Biotechnology and Bioengineering (2023)、ACS Synthetic Biology(2022、2023)等本领域权威期刊。

通信作者

杨艳坤副教授是江苏省“六大人才高峰”的入选者。从事发酵工程、微生物学、分子生物学、合成生物学的研究，主要承担分子生物学、生物化学、高级分子生物学课程的讲授工作。发表SCI研究论文60多篇，参编专著3部；申请发明专利20多项；主持国家重点研发计划、863、国家自然科学基金等国家级和省部级科研项目8项；主持企业横向项目7项；获得商业联合会全国科技进步2等奖1项；指导学生获得国家级和省级竞赛奖3项。

引用格式

柯文锋, 李诗洁, 郑梦林, 等. Expi293F表达重组鲎C因子用于荧光法内毒素检测[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(2):106-111.